Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Поставленные в Проекте цели на первый год полностью достигнуты. В ходе выполнения Проекта получены результаты по всем основным его направлениям. Была разработана пошаговая методика синтеза ряда катионных макроциклов, содержащих положительно заряженные четвертичные аммониевые и имидазолиевые фрагменты, на основе п-трет-бутилтиакаликс[4]арена с высокими выходами. Разработанная методика заключается в аминолизе сложноэфирных производных тиакаликсарена аминами, содержащими третичную аминную или имидазольную группы, с последующим алкилированием полученных соединений галоген-содержащими реагентами с различной длиной алкильного заместителя, и заменой бромид- и иодид-анионов в синтезированных четвертичных аммониевых и имидазолиевых солях на хлорид-анионы с помощью ионнообменной смолы. Впервые разработана синтетическая стратегия синтеза новых водорастворимых карбоксилатных производных тиакаликс[4]арена в конфигурациях конус, частичный конус и 1,3-альтернат, заключающаяся в алкилировании макроциклических третичных аминов реагентами, содержащими высоко реакционно-способный фрагмент Br-CH2-CO-R (R = OEt или N(CH2COOEt)2), с последующим хемоселективным гидролизом сложноэфирных фрагментов. На основании результатов анализа и систематизации литературных данных, а также имеющегося у научного коллектива опыта в области самосборки макроциклов и ионов серебра, была опубликована обзорная статья [1]. Статья систематизирует имеющийся на данный момент практический опыт исследователей в области синтеза и изучении свойств супрамолекулярных систем макроциклических соединений (в том числе тиакаликсаренов) и ионов серебра. Обобщённые данные позволяют коллективу разработать подходы к созданию материалов - модификаторов сенсоров, включающих неэлектропроводные молекулы макроциклов и наночастицы серебра. Впервые были получены новые производные фенотиазина, содержащие сложноэфирные, карбоксильные, гидроксильные, амидные и аминогруппы, а также и четвертичные аммониевые фрагменты. Для синтеза фенотиазина с амидными и гидроксильными группами были применены дивергентный (непосредственный аминолиз аминоэтанолом сложноэфирного производного фенотиазина) и конвергентный (аминолиз этилового эфира 4-аминобейнзойной кислоты аминоэтанолом с последующим взаимодействием продукта с фенотиазином) методы синтеза. Было показано, что итоговый выход целевого соединения при конвергентном подходе составил 38.4%, что значительно выше, чем при дивергентном подходе (15%). Показано, что при добавлении третичных аминов к фенотиазину в спиртах происходит олигомеризация, в результате которой были впервые получены олиго(3,10)фенотиазины. Получение полимерных форм фенотиазинов химическим способом – задача нетривиальная, и химическое получение (3,10)олигомеров, состоящих из 3-6 фрагментов фенотиазина, является прорывным результатом, развитие которого открывает возможность получения полифенотиазинов. С помощью методов динамического светорассеяния и просвечивающей электронной микроскопии была исследована самосборка полученных производных тиакаликс[4]арена в воде. Показано, что изученные соединения образуют в воде наночастицы с низким индексом полидисперсности. С помощью метода динамического светорассеяния показано, что полученные тиакаликс[4]арены способны в воде образовывать двухкомпонентные супрамолекулярные системы с производными фенотиазина, при этом формируются частицы субмикронного размера. Установление электрохимических характеристик новых синтезированных материалов является неотъемлемой частью любого исследования, направленного на конструирование электрохимических (био)сенсоров. Проверка электрохимической активности новых соединений позволяет прогнозировать характеристики разрабатываемых устройств, проводить по результатам этой проверки скрининг наиболее оптимальных кандидатов на роль модификатора трансдьюсера и выявлять закономерности, связывающие химическую структуру новых соединений и их редокс-активность на поверхности электрода. В рамках первого этапа Проекта было подвергнуто электрохимическому изучению на поверхности стеклоуглеродного электрода производное фенотиазина N-фенил-3-(фенилимино)-3H-фенотиазин-7-амин (PhTz) [2]. По результатам исследования выявлены особенности электродной реакции PhTz на поверхности стеклоуглеродного электрода: смешанный режим переноса электрона, т.е. наличие процессов сорбции, электрохимическая квазиобратимость реакции и сильное влияние рН среды на формальный редокс-потенциал (Е0’) пары PhTz(ox)/PhTz(red). Была предложена схема электрохимических превращений нового соединения на поверхности стеклоуглеродного электрода, предполагающая перенос разного количества протонов водорода и электронов в реакциях, проводимых в кислых (рН<7) и щелочных (рН>7) средах. В ходе выполнения первого этапа разработана методика электрополимеризации нового производного фенотиазина PhTz. Установлены оптимальные условия проведения электросинтеза polyPhTz, включая диапазон сканирования потенциалов, состав фонового электролита, соотношение водной и органической частей рабочего раствора и его рН. Формирование пленки нового материала на поверхности стеклоуглеродного электрода подтверждено данными электронной микроскопии и спектроскопии электрохимического импеданса. Были определены параметры электронного переноса и его обратимости с использованием электрода, покрытого новым электрополимеризованным материалом на основе производного арилиминофенотиазина. Исходя из полученных величин, пленку polyPhTz можно отнести к редокс-активным непроводящим полимерам. Выполнена апробация электросинтезируемых покрытий в качестве модификатора индикаторного электрода при проведении потенциометрического титрования органических кислот и при определении ХПК (химическое потребление кислорода). Результаты проведенных работ позволили предложить протокол конструирования ДНК-сенсора, основанный на нековалентных взаимодействиях нового полимерного материала и молекул двухцепочечной ДНК. Продемонстрирована возможность дискриминации нативных и поврежденных (термическая денатурация и химическое окисление) молекул ДНК по данным спектроскопии электрохимического импеданса с использованием сконструированного ДНК-сенсора. 1. https://www.mdpi.com/1422-0067/21/4/1425 2. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468620305879

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Поставленные в Проекте цели на второй год полностью достигнуты. В ходе выполнения Проекта получены результаты по всем основным его направлениям. Была разработана методика синтеза новых производных п-трет-бутилтиакаликс[4]арена, содержащих одновременно четвертичные аммониевые, амидные и аминокислотные фрагменты, в конфигурациях конус, частичный конус и 1,3-альтернат. Разработанная методика заключается в аминолизе сложноэфирных производных тиакаликсарена аминами, содержащими третичные аминогруппы, с последующим алкилированием полученных соединений реагентами, содержащими сложноэфирные группы и фрагменты аминокислот. Последующим хемоселективным гидролизом сложноэфирных фрагментов в полученных соединениях были получены соответствующие карбоксилатные производные на основе тиакаликс[4]арена в трех конфигурациях – конус, частичный конус и 1,3-альтернат, в цвиттер-ионной форме. С высокими выходами был получен ряд макроциклических аммониевых солей и бетаинов. Впервые синтезирована серия катехол-содержащих оснований Шиффа на основе тетразамещенных по нижнему ободу производных тиакаликс[4]арена в трех стереоизомерных формах – конус, частичный конус и 1,3-альтернат. Методом УФ спектроскопии показано избирательное распознавание катионов меди (II) в ряду катионов d-металлов (меди (II), никеля (II), кобальта (II) и цинка (II)). С помощью ряда физических методов показано, что ионы меди (II) координированы по атому азота иминной группы и ближайшему атому кислорода катехольного фрагмента в производных тиакаликсарена. На основе комплексов 1,3-альтернат + Cu (II) были получены термостойкие органо-неорганические медь-содержащие материалы. Была изучена антибактериальная активность и цитотоксичность макроциклических четвертичных аммониевых солей, полученных на первом году выполнения Проекта по отношению к ряду грамположительных и грамотрицательных бактерий. Полученные соединения обладают высоким антибактериальным действием в отношении грамположительных (S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis) бактерий, сопоставимым с используемыми в продаже антисептиками хлоргексидином, мирамистином и бензалкония хлоридом. Было обнаружено, что большинство четвертичных аммониевых производных тиакаликс[4]арена в конфигурации 1,3-альтернат более эффективно подавляют рост исследуемых штаммов бактерий по сравнению с соединениями в конфигурации конус. Исследования цитотоксичности клеток фибробластов кожи человека продемонстрировали, что все соединения менее токсичны по сравнению с контрольными препаратами и имеют достаточно большое терапевтическое окно. При установлении механизма биологической активности было показано, что соединения в конфигурации конус адсорбируются на поверхности мембраны модельных везикул, в то время как включение липофильных алкильных фрагментов макроциклов в конфигурации 1,3-альтернат в мембрану приводит к «слипанию» везикул. Было изучено взаимодействие соединений, содержащих четвертичные аммониевые и карбоксильные фрагменты, с аминокислотами и рядом модельных белков – лизоцим, бычий сывороточный альбумин, гемоглобин в воде. Показано, что полученные аммониевые производные не взаимодействуют с аминокислотами и белками. Тиакаликс[4]арены в конфигурация конус, частичный конус и 1,3-альтернат, содержащие фрагменты иминодипропионой кислоты по нижнему ободу, взаимодействуют с лизоцимом и гемоглобином с образованием нанометровых и субмикронных ассоциатов. Были определены стехиометрия (1:1) и константы связывания белков (LogK = 3.36-5.10). Электрохимические исследования в рамках второго этапа Проекта были главным образом посвящены оценке того, как включение в состав изученного ранее N-фенил-3-(фенилимино)-3H-фенотиазин-7-амина (PhTz) карбоксильных и аминогрупп скажется на его электрохимическом поведении. Для того, чтобы дальнейшее сравнение результатов было корректным, экспериментальные условия (концентрация, диапазон потенциалов, рН, природа фонового электролита) для синтезированных молекул PhTz-(NH2)2 и PhTz-(COOH)2 не отличались от таковых для PhTz. Наличие новых электронодонорных аминогрупп в структуре PhTz-(NH2)2 облегчало процесс электроокисления по сравнению с PhTz. В случае PhTz-(COOH)2, наоборот, пики окисления на вольтамперограммах сдвигались в область положительных потенциалов, демонстрируя снижение реакционной способности молекулы. Электрохимическое поведение изученных соединений испытывало сильное влияние рН. Для карбоксильного производного электродная реакция сопровождалась переносом 2 электронов и 2 ионов водорода во всем изученном диапазоне рН рабочего раствора, для PhTz-(NH2)2 установлена область рН с вдвое меньшим числом переносимых ионов водорода в лимитирующей стадии. Более того, для аминированного производного зарегистрирован переход между протонированной окисленной и протонированной восстановленной формами, ранее не обнаруженный для PhTz. Таким образом, можно говорить о положительном влиянии аминогрупп на стабильность восстановленной протонированной формы соединения в кислой области рН. По результатам исследования для обоих производных была предложена и экспериментально подтверждена схема переходов между окислительно-восстановительными состояниями. Сравнение кинетических параметров реакций с участием PhTz-(NH2)2, PhTz-(COOH)2 и PhTz говорит о незначительном влиянии дополнительных функциональных групп на скорость электродной реакции (k0 для PhTz 11×10-4 см×с-1, для PhTz-(NH2)2 и PhTz-(COOH)2 ~ 8×10-4 см×с-1). Новые изученные соединения демонстрировали различную склонность к электрополимеризации. В целом по данным пьезокварцевого микровзвешивания и спектроскопии электрохимического импеданса количество электроосаждаемого в ходе электролиза продукта снижалось. По эффективности электросинтеза полимера изученные молекулы составили ряд PhTz > PhTz-(NH2)2 > PhTz-(COOH)2. Отмечается сильное негативное влияние карбоксильных групп на электрополимеризацию PhTz-(COOH)2. Электрохимическое изучение двухкомпонентных систем «производное фенотиазина: макроцикл» позволило выявить позитивный вклад двух макроциклов на кинетические характеристики электродной реакции PhTz (карбоксильный тиакаликс[4]арен в конфигурации 1,3-альтернат и аммониевый тиакаликс[4]арен в конфигурации конус). Их включение обеспечило наилучшие характеристики проницаемости для низкомолекулярных соединений. Синтезированные материалы демонстрировали значительное изменение сопротивления переноса заряда в спектроскопии электрохимического импеданса после иммобилизации ДНК путем физической адсорбции. Это было использовано при конструировании ДНК-сенсора для количественного определения противоракового препарата доксорубицина в диапазоне концентраций от 0.003 нМ до 1 нМ.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Поставленные в Проекте цели на третий год полностью достигнуты. В ходе выполнения Проекта получены результаты по всем основным его направлениям. Была разработана методика получения моно- и дизамещенных производных фенотиазина на основе двух синтетических путей – (1) реакция трииодида 3-(фениламино)фенотиазин-5-ия с рядом ариламинов и (2) взаимодействие различных 3-N'-ариламинофенотиазинов с анилином. Показано, что первый синтетический путь характеризуется более высокими выходами, в то же время второй синтетический путь может быть использован для синтеза 3,7-ди(N'-ариламино)фенотиазинов со стерически нагруженными ариламиновыми фрагментами. Установлено, что основные факторы, влияющие на реакционную способность 3-N'-ариламинофенотиазинов в реакциях с ариламинами – это сопряжение между ароматическими фрагментами и мезомерный эффект заместителя. С высокими выходами был получен ряд производных фенотиазина, содержащих сложноэфирные, трет-бутоксикарбонильные, сульфокислотные, гидроксильные и аминные группы. Методами динамического светорассеяния, УФ-спектроскопии, просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии были установлены характеристики (размер, форма) образующихся частиц при самосборке двух- и трехкомпонентных супрамолекулярных систем на основе производных тиакаликсарена, дизамещенных ароматических производных фенотиазина и биомолекул в водных и водно-органических средах. Было показано образование различной формы ассоциатов «карбоксилированный тиакаликсарен:лизоцим» в зависимости от конфигурации макроцикла, при этом монодисперсная система образовывалась в случае смеси «карбоксилированный тиакаликсарен (частичный конус):лизоцим» (1:1) через один день после смешения компонентов. С помощью УФ-спектроскопии и динамического светорассеяния было показано взаимодействие карбоксилированных тиакаликсаренов с аммонийным арилиминофенотиазином, и отсутствие взаимодействия аммониевых производных тиакаликсарена с карбоксилированным производным фенотиазина. Было установлено, что устойчивость двухкомпонентных систем «тиакаликсарен: арилиминофенотиазин» зависела от заряда фрагментов в их структурах. Методом динамического светорассеяния было показано образование коммутативных трехкомпонентных супрамолекулярных систем «карбоксилированный тиакаликсарен (частичный конус): аммонийный арилиминофенотиазин: лизоцим» при соотношении компонентов соответственно 1:2:1, которые состояли из субмикронных и микронных частиц. В отчетном периоде проведено исчерпывающее исследование электрохимического поведения новых монозамещенных производных фенотиазина, несущих нитро- и аминогруппы. Все соединения демонстрировали электрохимическую активность в широком диапазоне рН рабочего раствора. По данным циклической вольтамперометрии выявлен вклад природы заместителя на положение пиков окисления/восстановления. Электроноакцепторная нитрогруппа приводила к сдвигу равновесного редокс-потенциала в область более положительных значений, а аминогруппа – в противоположном направлении. Среди изученных превращений трех монозамещенных фенотиазинов к обратимым процессам можно отнести лишь превращения ариламинного производного. Введение в состав молекулы дополнительных групп, равно как и синтез симметричных дизамещенных производных, приводило к нарушению обратимости электрохимических процессов по критериям разности потенциалов пиков и соотношения токов пиков. Продемонстрировано влияние рН рабочего раствора на электрохимическое поведение новых соединений. Определены области рН, отвечающие максимальным токам изученных фенотиазинов. Для аминированного и незамещенного производных эта область составила 5.5 – 6.0 единиц рН, для нитропроизводного зарегистрировано последовательное снижение токов при увеличении рН. Анализ зависимостей токов пиков от скорости сканирования потенциала выявил сорбцию соединений на поверхности стеклоуглеродного электрода. Наиболее ярко это выражено для нитропроизводного. На основе зависимостей равновесного редокс-потенциала от рН предложена схема переходов между редокс-состояниями новых производных фенотиазина, предполагающая двухэлектронный перенос. Вычислены кинетические параметры электродных реакций новых соединений. Значения коэффициента переноса указывают на более высокое перенапряжение реакции электровосстановления для незамещенного соединения (α = 0.37) и обратимые реакции электроокисления для нитропроизводного (α = 0.60). Наибольшее значение гетерогенной константы скорости переноса электрона было получено для нитропроизводного (3×10-4 см/с), что может быть связано с его более интенсивной сорбцией. Определены условия одностадийного переноса трехкомпонентных систем «производное фенотиазина : тиакаликс[4]арен : биокомпонент» на поверхность стеклоуглеродного электрода посредством электрополимеризации. Наиболее выраженные вольтамперные сигналы были получены для систем при рН = 8.2, макроцикла, несущего аммониевые или карбоксильные фрагменты, в конфигурации 1,3-альтернат при мольном соотношении фенотиазин : макроцикл 4:1. Разработан ДНК-сенсор, сборка которого предполагала предварительное взаимодействие аммониевого производного макроцикла и молекул ДНК. Такой подход позволил улучшить операционные и аналитические характеристики сенсора в отношении интеркалятора ДНК. Было зарегистрировано в 1.5 раза большее изменение сигнала по сравнению с ДНК-сенсором без тиакаликс[4]арена. Предел обнаружения, достигнутый для цитостатического препарата доксорубицина, при введении макроцикла был снижен примерно на два порядка и составил 1.3 пМ.